遺伝子組込み技術

多座組込みでコピー数の向上と安定保持を実現

目的タンパク質を組換え酵母で安定的に生産するためには、その遺伝子を菌体内で安定的に保持させる遺伝子組換え技術が非常に重要です。一般的には、形質転換によって導入した目的遺伝子を組換え菌体内で保持する方法として、プラスミド型と染色体組込み型の 2種類があります。
旭硝子は、抗生物質を使わなくても導入した目的遺伝子のコピー数が安定的に保持できる染色体組込み型を採用しています。その基本技術として、分裂酵母が持つ3本の染色体上に13コピー存在するトランスポゾン様遺伝子Tf2を標的にした多コピー遺伝子組込み(多座組込み)技術を開発しており、目的遺伝子コピー数の向上と安定的な保持を実現しています。また、分裂酵母の染色体上のある特定の一か所を標的にした1コピー遺伝子組込み(単座組込み)技術も開発しており、短期間での各種プロモーターや宿主株などの比較検討ならびに最適化を可能にしています。

多座組込みによる組換え酵母の作製方法

単座・多座組込みベクター共に、両端の領域を用いて、 相同組換えによって、染色体上に組み込まれる。多座組込みでは、分裂酵母染色体に存在する 13個の Tf2座へのマルチーコピー遺伝子組込みが可能である。単座組込みでは、分裂酵母染色体のある特定1箇所へのシングルコピー遺伝子組み込が可能である。

P3分泌シグナルを用いた分泌発現カセットの設計

多座組込み株でのタンパク質発現安定性

あるワクチン用組換えタンパク質での生産安定性を多座組込み株と従来組込み株(単座への 8コピー多重組込株)で比較した結果を示す。2種類の組換え株を試験管で4回繰り返して継代培養を行い、菌体内タンパク質抽出液をSDS-PAGEで分析した結果、目的タンパク質の生産量とその継代安定性において多座組込み株のほうが優れていることが分かった。

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